Phản Ứng Miễn Dịch Huỳnh Quang (Immunofluorescence Assays)

Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang (immunofluorescence assays)

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang đã dược sử dụng trên từ năm 1944. Những người đầu tiên thực hiện kỹ thuật này là ông Coons, Creech và Jones.

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang bao gồm: Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp và Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp.

Nguyên lý kỹ thuật: Kháng nguyên + Kháng thể + Chất đánh dấu huỳnh quang + Nguồn sáng huỳnh quang.

Sự thành công của kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang phụ thuộc vào nhiều yếu tố:

1. Sự bảo quản kháng nguyên.
2. Đủ kháng thể để kết hợp.
3. Hệ thống kính hiển vi huỳnh quang chất lượng tốt.
4. Nhuộm cẩn thận và phương thức ủ ấm đúng.

Các chất nhuận huỳnh quang thường được dùng nhất để đánh dấu trong các thử nghiệm gắn kết sơ cấp là fluorescein isothiocynate (FITC) (hình 2.5). FITC là hợp chất màu vàng có thể gắn kết với các kháng thể mà không ảnh hưởng tới hoạt tính của của kháng thể. Khi bị kích thích với tia UV hay ánh sáng xanh ở bước sóng 290nm và 145 nm, FITC phát quang thành ánh sáng thấy màu xanh lá ở bước sóng 525 nm. Kháng thể đánh dấu FITC được dùng trong cả thử nghiệm kháng thể huỳnh quang trực tiếp hoặc gián tiếp.

Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang trực tiếp

Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang trực tiếp được dùng để phát hiện sự hiện diện của kháng nguyên. Kháng thể trực tiếp đáp ứng với kháng nguyên như là vi khuẩn hay virus được đánh dấu huỳnh quang với FITC. Mô hoặc các phết chứa sinh vật được gắn lên phiến kính và được ủ với kháng huyết thanh đã đánh dấu huỳnh quang. Sau đó rửa để loại bỏ những kháng thể không được bắt cặp. Khi được kiểm tra dưới kính hiển vi bằng nguồn sáng UV, các mẫu đã gắn với kháng thể sẽ phát sáng. Thử nghiệm này có thể phát hiện vi khuẩn khi số lượng của chúng rất thấp.
 

Quá trình nhuộm màu huỳnh quang trực tiếp và gián tiếp của kháng nguyên màng (mAg). Các tế bào được gắn lên phiến kính hiển vi. Trong phương pháp trực tiếp (a), các tế bào được nhuộn với kháng thể đã đánh dấu huỳnh quang4kháng mAg (FI). Trong phương pháp gián tiếp (b và c), các tế bào trước tiên được ủ với kháng thể kháng mAg sau đó được nhuộn với kháng thể sơ cấp gắn chất phát huỳnh quang.

Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

Thử nghiệm huỳnh quang gián tiếp được dùng để phát hiện kháng thể trong huyết thanh hoặc để xác định kháng nguyên trong mô hoặc trong môi trường tế bào. Khi để phát hiện kháng thể, kháng nguyên (các phết mô, lát cắt hoặc môi trường tế bào) được gắn trên phiến kính. Sau đó được ủ với huyết thanh nghi ngờ chứa kháng thể kháng kháng nguyên đó. Huyết thanh sẽ được rửa, chỉ để lại kháng thể đặc hiệu kết hợp với kháng nguyên. Các kháng thể này sẽ được nhìn thấy sau khi ủ kính phết trong kháng globulin có đánh dấu FITC. Sau khi các kháng globulin không gắn kết bị rửa để loại đi sẽ được kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang. Nếu có sự phát huỳnh quang thì chứng tỏ có sự hiện diện của kháng thể trong huyết thanh.

Thử nghiệm huỳnh quang gián tiếp có hai ưu điểm so với kỹ thuật trực tiếp. Vì từng phân tử kháng thể kết hợp với kháng nguyên sẽ tự bắt cặp với một vài phân tử kháng globulin nên huỳnh quang phát ra sẽ sáng hơn so với phương pháp trực tiếp. Tương tự, bằng việc sử dụng các kháng globulin chuyên biệt cho từng lớp globulin nhiễm nên từng lớp kháng thể chuyên biệt cũng sẽ được phát hiện.

Đếm dòng chảy tế bào

Đếm dòng chảy tế bào là một kỹ thuật được dùng để phát hiện kháng nguyên bề mặt tế bào. Nó bao gồm việc đánh dấu huyền phù tế bào với kháng thể đơn dòng đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu cho kháng nguyên bề mặt. Huyền phù tế bào đã rửa được chảy quan một chùm laser và đặc điểm của các tế bào đã đánh dấu và không đánh dấu được xác định. Đếm dòng chảy tế bào là một kỹ thuật định lượng nhanh để phân tích các hỗn hợp tế bào phức tạp và phát hiện các immunophenotype tế bào.

Sự phân tách các tế bào đã đánh dấu huỳnh quang bằng máy đếm dòng chảy tế bào. Trong ví dụ trên, hỗn hợp tế bào được nhuộn với hai kháng thể, một đặc hiệu cho kháng nguyên bề mặt A và một đặc hiệu cho kháng nguyên bề mặt B. Kháng thể kháng A được đánh dấu huỳnh quang (xanh dương), kháng thể kháng B được đánh dấu rhodamine (đỏ). Các tế bào đã nhuộm được cho vào bộ phận chứa mẫu của máy. Các tế bào được phun ra trong cùng một lúc từ một cái vòi rung nhỏ mà có thể tạo ra vi giọt có chứa một hay nhiều tế bào. Khi nó đi qua vòi, từng giọt sẽ nhận được một điện lượng nhỏ và máy tính sẽ điều khiển máy đếm dòng chảy tế bào để xác định chính xác khi nào giọt đó được tạo ra bằng một vòi nhỏ xuyên qua chùm sáng laser để kích thích phát quang. Cường độ huỳnh quang phát ra bởi từng giọt được ghi nhận bởi một đầu dò và hiện lên màn hình máy tính.

Nguồn: http://www.vbs.ac.vn